Metodologia de testes de germinação e de vigor para sementes de leguminosas e gramíneas nativas de importância para o bioma campo

No desenvolvimento das condições ótimas para a avaliação da viabilidade, através da determinação de métodos eficientes na condução dos testes de germinação e de tetrazólio, e do vigor, através do estudo das variáveis que influenciam a realização dos testes de condutividade elétrica e de envelhecimento acelerado, foram utilizadas sementes forrageiras nativas das gramíneas Paspalum dilatatum Poir., P. lividum Trin. ex Schltdl., P. nicorae Parodi, P. notatum Flügge, P. pauciciliatum Parodi Herter, P. plicatulum Michx., P. pumilum Ness, P. regnellii Mez, P. urvillei Steud e das leguminosas Desmodium incanum DC., Trifolium riograndense Burkart, Adesmia latifolia (Spreng.) Vogel. e Desmanthus depressus Humb. & Bonpl. ex Willd. Os trabalhos foram desenvolvidos no Laboratório de Análise de Sementes do Departamento de Plantas Forrageiras e Agrometeorologia da Faculdade de Agronomia/Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Os dados em porcentagem de germinação foram transformados em arco-seno√x/100. As médias foram comparadas pelo Teste de Tukey (P<0,05), de Dunnett (P<0,05) e análise de regressão. O delineamento experimental foi o completamente casualizado, com quatro repetições de 25 sementes cada. As condições adequadas de germinação, tipo de substrato, posição e temperatura utilizada, variaram conforme a espécie, mas de um modo geral as sementes de leguminosas mostraram bons resultados sobre substrato papel e em temperaturas alternadas. Nas gramíneas do gênero Paspalum, a condição papel, a posição sobre o substrato e as temperaturas constantes de 20 e 25°C e a alternada de 20-35°C destacaram-se das demais, para a maioria das espécies. A temperatura alta (40°C), o maior período de embebição (24 horas) e a concentração de 0,5%, de uma forma geral, apresentaram-se como as condições mais adequadas para condução do teste de tetrazólio nas espécies trabalhadas. A combinação 24 horas/25°C, para grande parte das leguminosas e gramíneas em questão, levou a uma liberação maior de lixiviados na realização do teste de condutividade elétrica. As condições de temperatura de 45°C e o período de exposição de 96 horas, de modo geral, afetaram de forma mais drástica a porcentagem média de germinação das sementes após o envelhecimento acelerado nas espécies estudadas.

Mapeamento de QTLs para tolerância ao frio e características de importância agronômica em arroz

A temperatura baixa é um estresse comum na cultura do arroz em regiões temperadas, portanto a tolerância ao frio é uma característica altamente desejável em genótipos brasileiros de arroz cultivados no sul do país, onde as temperaturas baixas prejudicam o estabelecimento da lavoura e diminuem o redimento de grãos. O mapeamento molecular é uma estratégia promissora para o estudo e compreensão de de características com controle complexo, tais como a tolerância ao frio em arroz. Com base nisso, os objetivos deste trabalho foram estudar a herança e herdabilidade das características de tolerância ao frio e das características de importância agronômica a serem maepadas, desenvolver um mapa molecular a partir da população segregante F2 proveniente do cruzamento IRGA 417 (Índica) x Quilla 66304 (Japônica) e identificar locos de características quantitativas (QTLs) para a tolerância ao frio no período de germinação e vegetativo e características agronômicas que diferenciam estas duas subespécies. Por fim, investigar a possibilidade de obter indivíduos recombinantes com caracteristicas agronômicas desejáveis e toleância ao frio em uma população F2 do cruzamento entre IRGA 417 x Quilla 66304. As análises das distrbuições de freqüências da geração F2 evidenciaram a dificuldade de estimar o número de genes que controlam as características analisadas, sendo que todas elas apresentam distribuição contínua e segregação transgressiva em relação aos genitores. O mapa foi construído com base em oito marcadores SSR e 42 marcadores do tipo AFLP com uma densidade média de marcador a cada 38,8 cM, sendo o comprimento total do mapa de 581,6 cM. Foram identificados cinco QTLs, sendo que um deles confere tolerância ao frio no período de germinação, e explica 15,9% da variação fenotípica deste caráteer. O outros quatro QTLs identificados foram para largura do grgão (21,3%), esterilidade de espiguetas (61,6%), estatura das plantas (34, 5%) e comprimento do grão (21,9%). A detecção de um QTL associado à tolerância ao frio no período de germinação, e outros QTLs associados à demais características a viabilidade deste tipo de análise. Entretanto, um mapa de ligação enriquecido é nceessário para permitir a detecção de outros QTLs associados às características estudadas. Plantas recombinantes com alto recrescimento de coleóptilo e outrras caracteristicas agronômicas desejáveis foram encontradas, o que evidencia o potencial da população proveniente de IRGA 417 x Quilla 66304 para o melhoramento da tolerância ao frio de genótipos de arroz adaptados ao Sul do Brasil.

Produção de porta-enxertos cítricos em recipientes e ambiente protegido no Rio Grande do Sul

O objetivo deste trabalho foi o de verificar a influência de diversos substratos sobre o desenvolvimento vegetativo inicial de porta-enxertos cítricos; avaliar a influência do tamanho de tubetes no desenvolvimento inicial e depois da repicagem de porta-enxertos; testar dois sistemas de irrigação; avaliar dois métodos de propagação inicial de porta-enxertos; testar a influência de diferentes densidades de empacotamento nas características físicas dos substratos e na germinação de porta-enxertos; avaliar a eficiência de um método não destrutivo no monitoramento de pH e da salinidade do substrato, e verificar o desenvolvimento vegetativo de porta-enxertos cultivados em citropotes com o uso de fertirrigação.

Adubação orgânica e mineral na produção, qualidade e composição química de sementes de abobrinha (Cucurbita pepo L. var. melopepo cv. Caserta)

Com o objetivo de estudar os efeitos da adubação sobre os componentes do rendimento, no potencial de produção, qualidade e composição química das sementes de C. pepo L variedade melopepo (Caserta) conduziu-se dois Estudos no Centro Agrícola Demonstrativo da Prefeitura de Porto Alegre/CAD, e no Laboratório de Análise de Sementes do Departamento de Plantas forrageiras e Agrometeorologia da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) nos períodos de 2000/01 e 2002/03. No primeiro estudo utilizou-se dois tipos de adubação uma orgânica (cama de aviário- 386g/cova), e outra mineral (fórmula 5-20-20). No segundo estudo, os tratamentos constaram de:T1= testemunha, T2= adubação mineral, e 4 doses de cama de aviário: T3= 63g/cova, T4= 125 g/cova, T5= 187g/cova, T6= 250g/cova. O delineamento experimental foi o de blocos casualizados com 4 e 3 repetições no primeiro e segundo estudos, respectivamente. Foram determinados: número de flores/planta, número de frutos/planta, peso médio de frutos, peso de sementes/fruto, número de sementes/fruto, peso de 1000 sementes, rendimento de sementes/área, germinação, emergência em campo, teste de frio, condutividade elétrica, comprimento de plântula, composição centesimal (Cinza, PB, EE, FB, ENN, NDT, EB, MO), macronutrientes (N, P, K, Ca, MG, S) e micronutrientes (Cu, Zn, Fe, Mn, Na, B). No primeiro estudo, tanto a adubação mineral como a adubação orgânica não afetaram os componentes do rendimento, o rendimento/área, a qualidade e a composição química de sementes. No segundo estudo, a aplicação de cama de aviário aumentou o rendimento de sementes de abobrinha e os teores de nitrogênio e ferro nas sementes, porém não afetou a qualidade. A dose de cama de aviário que proporcionou o melhor resultado foi de 250g/cova (3,12 t/ha).

Caracterização das sementes e propagação sexuada de Hypericum caprifoliatum Cham. & Schlecht (Clusiaceae)

A espécie Hypericum caprifoliatum é nativa do sul do Brasil. Devido a suas propriedades fitoterápicas é importante estabelecer seu cultivo e evitar sua exploração de forma extrativista. Os objetivos do trabalho foi caracterizar as sementes, avaliar a germinação, comparada à Hypericum perforatum e a sua propagação sexuada. Os experimentos foram conduzidos nos Departamentos de Plantas Forrageiras e Agrometeorologia e no de Horticultura e Silvicultura da Faculdade de Agronomia da UFRGS. Os estudos foram feitos com um lote de sementes de H. caprifoliatum obtido em Teutônia-RS, e um lote comercial de H. perforatum e incluíram: caracterização das sementes de H. caprifoliatum (peso de mil sementes - PMS, cor, tamanho); comparação da germinação com H. perforatum, em BOD e sobre papel, aos 34 dias, quanto à necessidade de luz (sem luz - 7 e 21 dias); tratamentos para superação de dormência (KNO3 - 0,2%, ácido giberélico - 0,5g/l, imersão em água à 70°C - 15 minutos); temperatura para teste de germinação em meio ágar-água - 6g/l (20°C, 25°C, 30°C e 20 - 30°C); emergência de plântulas aos 30 e 52 dias sob cultivo protegido e BOD, utilizando substrato comercial, sob diferentes temperaturas (20 - 30°C, 25°C,30°C); comparação do cultivo protegido e condições de campo para obtenção de mudas. Foram obtidos os seguintes resultados: As sementes apresentam PMS de 0,0205g, cor parda e 0,4 mm de comprimento. A germinação aos 34 dias com luz, foi 18%, e em H. perforatum 57 %; sem luz até 21 dias, foi 15% e, em H. perforatum, 55% com plântulas estioladas. A superação de dormência resultou em: testemunha 9%, KNO3 (0,2%) - 1%, ácido giberélico - 26%, água (70°C - 15 minutos) - 0%. A germinação em meio ágar-água, aos 60 dias: 20°C 64%, 20-30°C - 86%, 25°C - 18% e 30°C17%. A emergência (%) de plântulas em cultivo protegido, aos 30 dias, foi 33% e, em BOD: 20-30°C - 18%, 25°C - 36% e 30°C - 5%. A alteração da temperatura 30°C para 20°C, mantendo os outros tratamentos resultou, na contagem aos 52 dias: 20-30°C - 18%, 25°C - 42 % e 20°C - 29%. Mudas mais vigorosas foram obtidas em condições de campo. Os resultados indicam necessidade de luz, superação de dormência e temperatura inferior à 25°C para germinação de H. caprifoliatum, sendo possível sua propagação sexuada.

Influência ambiental e de parâmetros agronômicos na produção de poejo (Cunila galioides Benth.)

Cunila galioides (Lamiaceae), conhecida popularmente como poejo, é uma planta nativa encontrada em regiões de campos de altitude do sul do Brasil. Devido suas propriedades químicas é empregada na medicina popular e apresenta potencialidades de utilização como planta aromática, visando a extração do óleo essencial. Neste sentido, foram desenvolvidos quatro experimentos com o objetivo de gerar subsídios para a exploração comercial desta espécie, avaliando a influência de alguns parâmetros agronômicos e ambientais na produção quantitativa e qualitativa em três quimiotipos. Os experimentos desenvolvidos incluíram a propagação sexuada e assexuada, diferentes níveis de calagem aplicada ao substrato, distintos níveis de alumínio em hidroponia e o cultivo em condições de campo em cinco regiões agroecológicas no Rio Grande do Sul utilizando-se nove populações. Os resultados demonstraram que é possível realizar a propagação por sementes ou estaquia. A taxa de germinação de sementes é baixa, aumentando consideravelmente utilizando-se tratamentos de superação de dormência. A estaquia mostrou-se eficiente, mesmo sem a utilização de hormônios, indicando que o poejo é uma espécie de fácil enraizamento. A calagem mostrou efeito na produção de biomassa, teor e composição química do óleo essencial, ocorrendo interação entre quimiotipo e dosagem de calcário Foram observadas diferenças de tolerância ao alumínio entre os quimiotipos com aumento na concentração de flavonóides nas populações tolerantes. O cultivo em cinco regiões do Estado mostrou diferenças de produção de biomassa entre as populações e entre os locais, ocorrendo interação genótipo x ambiente. A composição química do óleo essencial das populações manteve-se praticamente estável, em todos os locais, com algumas variações. Observou-se, uma maior concentração de sesquiterpenos em alguns óleos essenciais que pode ser atribuída ao estresse ambiental.

Propagação de espécies nativas com potencial ornamental : Kelissa brasiliensis (Baker) Ravenna e Sinningia lineata (Hjelmq.) Chautems

A pesquisa em tecnologia de sementes contribui para a manutenção de bancos de germoplasma. Kelissa brasiliensis (Baker) Ravenna e Sinningia lineata (Hjelmq.) Chautems são espécies nativas com potencial ornamental. Os objetivos deste trabalho foram desenvolver testes para a germinação de sementes, conhecer a qualidade fisiológica de lotes coletados in situ, desenvolver protocolos de propagação vegetativa e conhecer estratégias reprodutivas no ambiente. Avaliaram-se o vigor, bem como o comportamento germinativo das sementes em diferentes substratos, temperaturas e condições de luz. Foram realizados experimentos com propagação vegetativa de S. lineata. O trabalho foi conduzido no Laboratório de Sementes da Fepagro, no Jardim Botânico de Porto Alegre e na Faculdade de Agronomia da UFRGS. Durante as coletas, foi feita a observação dos nichos das espécies. O delineamento experimental foi completamente casualizado com quatro repetições de 10 e 20 sementes para K. brasiliensis e S. lineata, respectivamente; para S. lineata, três tratamentos com 17 repetições foram utilizados no experimento com estaquia, e nove tratamentos com quatro repetições para o teste de divisão dos tubérculos. A comparação das médias foi realizada através do teste de Duncan (P<0,05). A temperatura mais adequada para a germinação de sementes de K. brasiliensis foi 10ºC, o que explica a sua restrita distribuição ao bioma Pampa; a combinação 24h/25ºC levou a uma liberação maior de lixiviados na condutividade elétrica; o envelhecimento acelerado (72 h em 41ºC e 100% de umidade) não provocou redução significativa no percentual de germinação das sementes de K. brasiliensis. Já as sementes de S. lineata não germinaram após serem expostas ao estresse. A temperatura mais adequada para o teste de germinação de sementes de S. lineata foi 20ºC; para ambas espécies, o substrato papel e a presença de luz foram as condições mais adequadas para a germinação. S. lineata demonstrou ser facilmente propagada por sementes e via assexuada, o que revelou a rusticidade característica das espécies rupícolas.

Tratamento com calor no controle de Botryosphaeria dothidea (Moug.) Ces. & De Not.) em maçãs cv. Fuji

A necessidade de se prolongar o período pós-colheita fez com que a utilização de tratamentos em pós-colheita com o uso de defensivos agrícolas aumentasse nas últimas décadas. No entanto, a preocupação de consumidores quanto a resíduos as deficiências de controle observadas incentivaram a procura por tratamentos alternativos, entre os quais os tratamentos com calor vem sendo testados em frutos de várias espécies. No presente trabalho estudou-se o efeito do tratamento com calor no crescimento do micélio e germinação dos conídios de Botryosphaeria dothidea e, avaliou-se a viabilidade da termoterapia com calor, isolada ou em combinação com carbonato de sódio no controle da podridão branca e na manutenção da qualidade das maçãs ‘Fuji’ em diferentes estádios de maturação, mantidas ou não sob armazenamento refrigerado. Foi objetivo também verificar a expressão de genes que são regulados durante a interação maçã-Botryosphaeria dothidea, após tratamento com calor. Os experimentos foram conduzidos testando-se combinações de diferentes temperaturas e períodos de exposição ao calor sobre o patógeno B. dothidea e sobre frutos inoculados e não inoculados artificialmente com o patógeno. Os resultados obtidos sobre o patógeno mostraram que, independente da concentração de caldo batata-dextrose (BD) utilizada na suspensão, 45% dos conídios de B. dothidea germinaram nos frutos após 24h e 91% após 48h de incubação a 26°C. Constatou-se um aumento significativo da germinação dos conídios quando acrescentado 2,4% de caldo BD a suspensão. Sobre o efeito da temperatura no patógeno, as temperaturas inferiores a 62°C, em qualquer período de exposição não foram capazes de inibir o micélio do patógeno. Os conídios submetidos à temperatura de 58°C somente foram inativados quando o tratamento foi estabelecido por 60s. A termoterapia com calor associada ou não ao carbonato de sódio reduziu a incidência e severidade da doença podridão branca. A severidade da doença foi influenciada pelo estádio de maturação dos frutos verificando pelo aumento no número de lesões/fruto quanto mais avançada a maturação das maçãs. Os resultados obtidos no RT-PCR evidenciaram que os protocolos utilizados não produziram RNA de alta qualidade e desta forma inviabilizaram a análise da expressão diferencial dos genes na interação maçã-B.dothidea.

A assembléia de pequenos mamíferos da floresta paludosa do faxinal, Torres-RS : sua relação com a borda e o roedor Akodon montensis (Rodentia, Muridae) como potencial dispersor de sementes endozoocóricas

Embora a assembléia de pequenos mamíferos desempenhe diferentes e importantes papéis na dinâmica das florestas, o conhecimento sobre a riqueza e o papel ecológico desempenhado pelas espécies nas restingas do estado do Rio Grande do Sul é ainda limitado, tendo-se poucas informações ecológicas sobre quem são esses animais nos diferentes fragmentos de florestas e como é sua relação espacial em ambientes de borda. Apesar da relevância, poucos estudos buscaram verificar se a assembléia de pequenos mamíferos em fragmentos florestais é sensível aos efeitos de borda, qual a extensão da borda para esses animais e se ela varia em diferentes estações do ano. No extremo norte da planície costeira do estado do Rio Grande do Sul, em um fragmento de floresta paludosa, denominada “Faxinal”, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de investigar qual a riqueza e sucesso de captura de pequenos mamíferos, como é sua relação com a distância da beira do fragmento e se essa relação varia entre as estações do ano. Nos meses amostrais de janeiro (verão), abril (outono) e agosto (inverno) de 2004 foram colocadas armadilhas de arame de dois tamanhos nos estratos terrestre e arbustivo, em um gradeado com seis transecções paralelas que cobriram parte de formação florestal (3,17ha) e parte de campestre (0,31ha). A distância dos postos de captura do gradeado à beira mais próxima da floresta foram agrupadas em seis classes (1: 0-30m; 2: 31-70m; 3: 71-100; 4: 101-120; 5: 121-131; 6: 131-160m, no solo e 1: 0-20m; 2: 40-71m; 3: 80-100m; 4: 101-120m; 5: 121-131m; 6: 132-160m, no estrato arbustivo) para verificar se os dados de sucesso de captura das espécies de pequenos mamíferos diferem entre os fatores distância da beira e períodos amostrais (estações do ano). Onze espécies de pequenos mamíferos foram capturadas somente na parte florestada do gradeado (sucesso de captura total de 15,49%), sendo que maior riqueza, número de indivíduos e de capturas foram de roedores e no estrato terrestre. As espécies mais capturadas foram Akodon montensis (154 indivíduos), Oligoryzomys nigripes (34 indivíduos), Brucepattersonius iheringi (19 indivíduos), Oryzomys angouya (12 indivíduos) e Micoureus cf. demerarae (8 indivíduos) e Didelphis albiventris (7 indivíduos). O mês amostral de inverno foi aquele que apresentou maior riqueza, maior sucesso de captura e maior biomassa. As análises demonstraram relação significativa entre o sucesso de captura do conjunto das espécies de pequenos mamíferos capturadas no solo e a distância da beira, cuja relação esteve fortemente associada à estação do ano. A estrutura e/ou composição da assembléia diferiram entre as duas primeiras classes de distância, que por sua vez diferiram das demais. Isso indica que a assembléia de pequenos mamíferos, capturada no solo, é sensível à beira da floresta e que a sensibilidade varia conforme a estação do ano. Por outro lado, quando avaliada individualmente a relação para a espécie dominante Akodon montensis, o sucesso de captura do roedor não evidenciou com nitidez diferença entre as classes de distância, mas houve diferença entre os períodos amostrais, sendo o mês amostral com menor média de temperatura anual aquele com maior número de indivíduos e de capturas. Além disso, por Akodon montensis ter sido a espécie mais comum e abundante em todos períodos amostrais e em todos os pontos do gradeado, coletou-se 249 amostras fecais para investigar a capacidade dessa espécie em realizar dispersão endozoocórica As amostras coletadas foram analisadas sob lupa para verificar se existiam sementes intactas e, quando colocadas em experimento de germinação, se seriam capazes de germinar. O registro de sementes inteiras nas fezes de Akodon montensis e o tratamento dado às sementes, de não comprometer a capacidade de germinação, permite que a espécie seja, ao menos em parte, considerada legítima e efetiva dispersora de Ficus organensis e de Piper cf. solmisianum

Vegetação espontânea e banco de sementes do solo em área agrícola estabelecida sobre campo natural

O conhecimento da ecologia das plantas espontâneas e de seu banco de sementes do solo (BSS) em áreas agrícolas pode contribuir para a proposição de técnicas agronômicas de manejo integrado dessas plantas. Ao mesmo tempo, este conhecimento é importante para situações em que se deseja a restauração, a partir do BSS, de áreas de campo natural impactadas pelo cultivo. O trabalho teve o objetivo de verificar a influência de diferentes práticas de manejo em cultivos agrícolas, estabelecidos sobre campo nativo da Depressão Central do RS (30º05´S, 51º40´O, alt. 46 m, prec. 1398 mm) sobre a vegetação espontânea e sobre o seu BSS. A partir de um experimento com diferentes sistemas de cultivo (semeadura direta – SD, preparo reduzido – PR, e preparo convencional – PC) em três parcelas dispostas em sete blocos, efetuaram-se duas avaliações (maio e outubro de 2002) da composição florística da vegetação e do BSS, em cada sistema de cultivo. A vegetação foi avaliada através da escala de Braun-Blanquet, em 24 quadros de 0,25 m2 por parcela. Para o levantamento do BSS de cada parcela, amostras de solo foram coletadas e postas a germinar em casa de vegetação, e as plântulas foram contadas e identificadas. Foram realizados quatro ciclos de germinação para avaliar a quantidade máxima possível de sementes no BSS. Variáveis ambientais foram registradas com a finalidade de relacionar com os dados obtidos. Análises estatísticas dos dados (ordenação, agrupamento, autoreamostragem bootstrap e testes de hipóteses) foram realizadas por meio dos aplicativos computacionais MULTIV e SYNCSA. O sistema de semeadura direta (menor revolvimento do solo), proporcionou maior número de espécies espontâneas perenes na vegetação do que os preparos reduzido e convencional. Brachiaria plantaginea foi a espécie mais abundante, tanto na vegetação quanto no BSS, tendo menor abundância-cobertura e freqüência na semeadura direta. Desmodium incanum apresentou potencial para restauração de áreas campestres, nas parcelas de semeadura direta com três anos de cultivo de verão e dois de inverno. Algumas variáveis de solo, como pH e teor de matéria orgânica da camada superficial de 0-5 cm do solo, apresentaram associações positivas com a vegetação e com o BSS. Os resultados indicam que diferentes sistemas de cultivo influenciam a composição da vegetação espontânea e do BSS, e que determinadas espécies respondem diferentemente a estes efeitos. Apesar dessas constatações, a aplicação dos resultados deve ser feita com precaução, havendo a necessidade de estudos de longo prazo para revelar a dinâmica temporal da vegetação espontânea em cultivos nas condições da Depressão Central do Rio Grande do Sul.

Caracterização molecular e morfofisiológica de diferentes isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae e análise morfológica do processo de infecção em Boophilus microplus

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.